HPAA
ÖZ
İnsan mide patojeni Helicobacter pylori ile enfeksiyon kronik gastrit, peptik ülser ve mide kanserine yol açabilir. Tüm H. pylori suşları, H. pylori enfeksiyonuna karşı bir aşı için umut verici bir aday olan yüzeyde lokalize protein HpaA'yı ifade eder. HpaA'nın fizyolojik önemini incelemek için, hpaA geninin bir mutasyonu, fareye uyarlanmış bir H. pylori suşuna dahil edildi. HpaA geninin kesintiye uğramasının aşağı akış genlerinde herhangi bir polar etkiye neden olmadığını veya ikinci bir bölge mutasyonu ile ilişkili olduğunu doğrulamak için, mutant ve vahşi tip suşların protein ekspresyon modelleri iki farklı proteomik yaklaşımla karakterize edildi. Dış zar protein profili için nano-sıvı kromatografi-Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans kütle spektrometresi ile birleştirilmiş tam hücre özütlerinin ve alt hücresel fraksiyonlamanın iki boyutlu diferansiyel jel içi elektroforez analizi, mutant ve vahşi arasındaki protein profilinde sadece küçük farklılıklar ortaya çıkardı -tip suşlar. Bu nedenle, mutant suş, iyi kurulmuş bir fare modelinde kolonileşme yeteneği açısından test edildi. Yabani tip suş ile aşılama, ağır şekilde H. pylori ile enfekte olmuş farelere yol açarken, HpaA mutant suşu kolonizasyon oluşturamadı. Bu nedenle, proteomik analizi ve in vivo çalışmaları birleştirerek, HpaA'nın farelerde H. pylori kolonizasyonu için gerekli olduğu sonucuna vardık.
H. pylori adhesin A (HpaA), başlangıçta sialik asit bağlayıcı adhezin olarak tanımlanan, yüzeyde bulunan (7, 14, 20) bir lipoproteindir (25), ancak destekleyici kanıtlar hala eksiktir. H. pylori ile enfekte bireylerden elde edilen antikorlar tarafından tanınır (23, 39) ve HpaA proteininin ekspresyonunun daha önce H. pylori izolatları arasında yüksek oranda korunduğu bulunmuştur (9, 39). Dahası, genomik çalışmalar (2, 32) HpaA'nın diğer bilinen proteinlerle önemli bir dizi homolojisi göstermez. Birlikte ele alındığında bu, HpaA'yı H. pylori enfeksiyonuna karşı bir aşı antijeni olarak varsayılan bir aday yapar.
Bu çalışmada, kolonizasyonda HpaA'nın rolünü incelemek için fareye uyarlanmış H. pylori Sydney suşu 1'de (SS1) bir HpaA mutantı oluşturduk. Birlikte transkripsiyon nedeniyle, yapılandırılmış gen mutasyonları, polar etkilere, yani bir operonda aşağı akım genlerin ekspresyonunu inhibe etme potansiyeline sahiptir. Ek olarak, bir genin devreden çıkarılmasının diğer genleri önceden tahmin edilemeyen bir şekilde etkileyebileceği gösterilmiştir (30). Bu nedenle, bir mutantı incelerken, proteomik analiz, bu değişikliklerin ne olabileceğine dair önceden bilgi sahibi olmadan protein ekspresyonundaki değişiklikleri izlemek için uygun bir yöntem sunar.
Bu çalışmanın ilk amacı, fareye uyarlanmış SS1 suşu ve onun izojenik HpaA mutantının hpaA'nın aşağı akışında bulunan genlerin protein ekspresyonu dahil olmak üzere genel protein profilini incelemekti. Bu, bakterilerin tam hücre özütlerinin DIGE analizi ile karşılaştırıldığı proteomik bir yaklaşımla başarıldı. Ayrıca hücre altı fraksiyonlama ve tek boyutlu sodyum dodesil sülfat (SDS) -poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) analizini nano-LC Fourier dönüşümü (FT) iyon siklotron rezonansı (ICR) (FT-ICR) MS ve tandem MS (MS / MS) SS1 vahşi tip ve mutant suşların OMP profillerini karşılaştırmak için analiz eder. HpaA'nın konakçıda hayatta kalmak için gerekli olup olmadığını belirlemek için, farelere H. pylori SS1 veya HpaA mutant suşu ile enfekte edildi ve kolonizasyon seviyeleri
MALZEMELER VE YÖNTEMLER
SS1 hpaA-negatif / eksik mutant SS1'in (ΔhpaA) yapımı.
HpaA mutantı, ilk olarak H. pylori suşu CCUG 17874'te, hpaA geninin 450 bp'lik bir delesyonu ile sonuçlanan iki aşamalı bir amplifikasyonla oluşturuldu (nazikçe P.Doig ve arkadaşları, Astrazeneca Research Center, Boston, MA) 1.4 kb'lik bir kanamisin kasetinin (25) yerleştirilmesi. Mutasyon, H. pylori CCUG 17874'ten doğal dönüşüm ile fareye uyarlanmış SS1 suşuna aktarıldı. Beş kanamisine dirençli transformant, kanamisin kasetinin yerleştirildiğini doğrulamak için iki HpaA'ya özgü primer (ileri primer, 5′-GGCGTAGAAATGGAAGCG-3 ′; ters primer, 5′-CCCAAGCTTCATCAGCCCTTAAATACACG-3 ′) (21) ile PCR ile analiz edildi. hpaA geni, vahşi tip SS1 suşununkinden daha büyük bir PCR ürünü ile sonuçlanır. Doğru yerleştirmeye sahip transformantlardan biri ayrıca SDS-PAGE ve HpaA'ya özgü monoklonal antikor HP30-1: 1: 6 ile immünoblotlama ile karakterize edildi (9). Bu suş, SS1 (ΔhpaA), immünoblotta negatifti.
Suşlar ve kültür koşulları.
Fareye uyarlanmış H. pylori suşları SS1 (CagA + VacA + Ley) (19) ve SS1 (ΔhpaA) tüm deneylerde kullanılmış ve stok kültürler olarak -70 ° C'de saklanmıştır. SS1 ve SS1'den (ΔhpaA) antijenlerin hazırlanması için bakteriler, mikroaerofilik koşullar altında (% 10 CO2,% 6 O2 ve% 84 N2) Kolombiya-Iso agar plakalarında 3 gün boyunca birleşmek üzere büyütüldü. SS1 (ΔhpaA), 25 μg / ml kan ile desteklenen kültürler haricinde, deney boyunca SS1 ile aynı şekilde kültürlendi.amisin.
Büyüme eğrileri.
SS1 ve SS1 (ΔhpaA) önce Kolombiya-Iso plakalarında 2 ila 3 gün boyunca birleşecek şekilde büyütüldü ve ardından 2 ml Brucella broth (Difco Laboratories) içinde 600 nm'de (OD600) 0.3 (1.5 × 109 bakteri) optik yoğunluğa yeniden süspanse edildi / ml). On altı dişi C57BL / 6 faresi, daha önce tarif edildiği gibi anestezi altında (Isoflurane; Abbott Scandinavia Ab, Solna, İsveç) Brucella besiyerinde yaklaşık 109 CFU H. pylori SS1 veya SS1 (ΔhpaA) ile oral yoldan enfekte edildi (27).
Enfekte farelerde H. pylori SS1 (vahşi tip) ve SS1 (ΔhpaA) tespiti. (i) Kantitatif kültür.
Farelerin kolonizasyonundaki SS1'in kinetiği, 2 ila 8 haftalık enfeksiyon arasında stabil kolonizasyon gösteren iyi karakterize edilmiştir (27). Farelerde SS1 (ΔhpaA) ile kolonizasyon kinetiğini belirlemek için, hayvanlar enfeksiyondan sonra çeşitli zaman noktalarında (3 gün, 3 hafta ve 8 hafta) öldürüldü. Mideler çıkarıldı ve gıda kalıntılarını çıkarmak için fosfat tamponlu salin ile yıkandı. Midenin bir yarısı daha önce tarif edildiği gibi kantitatif kültür için kullanıldı (27) ve diğer yarısı, PCR ile H. pylori'ye özgü genlerin saptanması için kullanıldı. SS1 (ΔhpaA) ile enfekte edilmiş farelerden alınan mide homojenatları, mide enfeksiyonu sırasında antibiyotik direncini kaybedip kaybetmediklerini incelemek için kan Skirrow plakalarında hem kanamisin içeren hem de içermeyen kültürlendi.
SONUÇLAR
H. pylori suşları SS1 ve SS1'deki (ΔhpaA) başlıca proteom bileşenlerinin karşılaştırılması.
HpaA mutantının yapısını takip eden hiçbir spesifik protein ekspresyon değişikliğinin olmadığını belirlemek için, H. pylori suşu SS1'in proteomunu ve izojenik mutantını 2-DE bazlı DIGE sistemi ile analiz ettik. DIGE teknolojisi ile uyumlu hücre liziz tamponunun kullanılması ve 3 ila 10 pH aralığında izoelektrik odaklanma ile, dört kopyadaki her bir numuneden 800'den fazla farklı protein noktası, DeCyder yazılımı ve ardından manuel düzeltme ile tespit edildi. SS1 suşu ve SS1 (ΔhpaA) mutantındaki ekspresyon profillerinin analizi, önemli ölçüde değişen bir seviyeye (P <0.05) sahip az sayıda noktanın (13) tanımlanmasıyla sonuçlandı. Bu noktalardan sekizinin aşağı regüle edildiği ve beş noktasının SS1 (ΔhpaA) mutantında yukarı regüle edildiği bulundu (Şekil 1) .1). Proteinlerin tanımlanması için, bir preparatif jel Sypro ruby ile boyandı ve noktalar jelde sindirildi ve nano-LC FT-ICR MS ve MS / MS ile analiz edildi. Tablo1.1'de gösterilen proteinleri başarıyla belirledik. Özellikle, hpaA'nın aşağı akışında yer alan tig geninin kodladığı tetikleme faktörü, her iki suşta da benzer seviyelerde ekspresyon gösterdi (Şekil 11 ve 2) .2). Bununla birlikte, Omp18 (HP0796) ne vahşi tip suşta ne de mutantta saptanmıştır. Bu nedenle, hpaA geninin bozulmasının, aşağı akış geni omp18'in transkripsiyonunu etkilemediğinden emin olmak için, SS1 ve SS1 (ΔhpaA) mutant suşu üzerinde omp18'e özgü bir RT-PCR gerçekleştirildi ve bu, Omp18'in her iki suş (veriler gösterilmemiştir).
Enfekte farelerde bakteri tespiti.
H. pylori kolonizasyonu hem kantitatif kültür hem de H. pylori'ye özgü PCR ile tespit edildi. SS1 (ΔhpaA) için kolonizasyon modelini değerlendirmek için, fareler referans olarak SS1 (ΔhpaA) veya SS1 ile enfekte edildi ve ardından 3 gün ila 2 ay arasında değişen çeşitli zaman noktalarında öldürüldü. SS1 ile enfekte olan fareler, incelenen tüm zaman noktalarında büyük bir kolonizasyon gösterdi, ancak kültür yoluyla (Şekil (Şekil 5) 5) veya H. pylori ile SS1 (ΔhpaA) ile enfekte olmuş farelerin midelerinde bakteri tespit edilemedi. - herhangi bir zaman noktasında belirli PCR (veriler gösterilmemiştir). SS1'in (ΔhpaA) midede kolonizasyon sırasında kanamisin direncini kaybetmediğini doğrulamak için bakteriler kanamisin içeren ve içermeyen plakalar üzerinde büyütüldü. Bununla birlikte, kanamisin içermeyen plakalarda kültürden sonra da hiçbir bakteri tespit edilememiştir (veriler gösterilmemiştir).
TARTIŞMA
Hayvan modellerinde yapılan bağışıklama çalışmalarında birçok kolonizasyon ve virülans faktörü koruyucu antijenler olarak değerlendirilmiştir (17, 22). Bir bakteri proteininin bir aday aşı antijeni olarak kabul edilmesi için, tercihen korunması (yani, tüm suşlarda mevcut olması), salgılanması veya yüzeyde lokalize olması ve immünojenik (yani, bağışıklık sistemini uyarabilen) olması gerekir. HpaA tüm bu kriterleri karşılar; HpaA'yı kodlayan gen, tüm H. pylori izolatlarında bulunur ve bunlar tarafından eksprese edilir (9, 39), bu da bakteri için değerli olduğunu gösterir. Dahası, H. pylori ile enfekte denekler, bakterinin yok edilmesinden sonra düşen HpaA'ya karşı serum antikor yanıtları oluşturur (23, 37) ve HpaA, immünojenisitesini göstererek dendritik hücrelerin olgunlaşmasını ve antijen sunumunu indükler (36). Ek olarak, HpaA'nın hem hücre içinde hem de bakteri yüzeyinde ifade edildiği gösterilmiştir (20, 25).
H. pylori enfeksiyonunda HpaA'nın önemini araştırmak için, daha önce açıklanan bir HpaA (25) mutasyonu, fareye uyarlanmış SS1 suşuna dahil edildi ve mutant suş, kolonizasyon kabiliyeti açısından test edildi veiyi kurulmuş bir hayvan modelinde immünojenite.
Mutasyonun aşağı akış genlerinde veya ikinci bölge mutasyonlarında herhangi bir hasara neden olmadığını doğrulamak için, H. pylori suşu SS1'in genel protein ekspresyon modelini incelemek için 2-D DIGE analizi gerçekleştirdik. HpaA haricinde yabani tip suşta saptanan tüm protein noktaları, mutant suşta bulundu. Bununla birlikte, 11 benzersiz proteine karşılık gelen 13 nokta, yabani tip suş ile karşılaştırıldığında mutantta ekspresyon seviyelerinde küçük değişiklikler gösterdi; bunlardan yedi proteinin aşağı regüle olduğu ve dört proteinin yukarı regüle edildiği bulundu. Tanımlanan bu proteinler, genetik veya fonksiyonel düzeyde ilişkili görünmemektedir. Ek olarak, protein ekspresyon seviyesindeki küçük değişikliklerin normalde bir bakteri suşu (35) içinde meydana geldiği gösterilmiştir (E. Carlsohn ve diğerleri, yayınlanmamış veriler). Yabani tipin ve izojenik mutantının DIGE analizindeki en önemli bulgu, hpaA'nın aşağı akışında yer alan tig geninin kodladığı tetikleme faktörünün her iki suşta da benzer ekspresyon seviyeleri göstermesiydi.
OMP'lerin toplam hücre ekstraktı gösteren standart 2-DE'de ayırt edilme eğiliminde oldukları iyi bilinmektedir. Bu, ilgilenilen proteinlerin hem zayıf çözünürlük hem de düşük ekspresyon seviyelerinden kaynaklanmaktadır ve bu nedenle, bu protein türleri için uygun bir izolasyon prosedürünün tasarlanması önemlidir. Tek boyutlu PAGE analizi ve triptik peptitlerin nano-LC FT-ICR MS ve MS / MS analizleri ile kombinasyon halinde OMP'lerin hücre altı fraksiyonasyonunu gerçekleştirdik. Bu yeni yaklaşımı kullanarak, araştırılan her iki suşta 20'den fazla dış zar proteini ve 8 flagella ile ilişkili protein belirledik. HpaA haricinde vahşi tip suşta bulunan tüm OMP'ler ayrıca mutant suşta ifade edildi. HpaA ve aşağı yönde gen omp18'in birlikte transkripsiyonu daha önce tarif edilmiştir (20). Bu nedenle, mutantta çevreleyen genler üzerindeki olası polar etkileri araştırmak için yapılandırılmış HpaA mutantında omp18 gen ürününün ekspresyonunu incelemek ilgi çekiciydi. Ne yazık ki, Omp18 proteini suşların hiçbirinde tespit edilmedi. Bununla birlikte, yabani tip ve mutant suşlardan omp18 mRNA'nın RT-PCR analizi, omp18'in her iki suşta da transkribe edildiğini açıkça gösterdi; bu, hpaA'nın bozulmasının, aşağı akım genleri üzerinde herhangi bir polar etkiye sahip olmadığını gösterdi (veriler gösterilmemiştir). Ek olarak, bildiğimiz kadarıyla, Omp18 proteini hiçbir zaman tespit edilmedi, bu da bunun çevrilmeyebileceğini, ancak sadece mRNA seviyesinde mevcut olabileceğini düşündürdü. İki suş arasında büyük bir fark tespit edilemediğinden, HpaA'nın fizyolojik öneminin değerlendirilmesi için bir hayvan modeline geçtik.
In vivo çalışmalar, vahşi tip SS1 suşu ile enfekte olan farelerin yoğun şekilde kolonize edildiğini, izojenik mutantının incelenen tüm zaman noktalarında fareleri kolonize edemediğini gösterdi. Bu nedenle, mutantın laboratuvar koşullarında büyümede önemli farklılıklar göstermemesi gerçeği, gözlemlenen fenotipin kesinlikle in vivo bağımlı olduğunu gösterir.
HpaA başlangıçta varsayılan bir N-asetilneuraminyllactose-bağlayıcı hemaglutinin olarak işaret edildi ve birkaç çalışma, in vitro yapışma çalışmalarında HpaA'nın işlevini aydınlatmaya çalıştı, ancak sonuçlar kesin değil. Örneğin, in vitro olarak mide hücre dizilerine bakteriyel bağlanma, inaktive edilmiş bir hpaA geninden etkilenmemiştir (25). Bununla birlikte, epitel hücre hatlarının, yeni izole edilmiş epitel hücrelerine kıyasla bakteriyel uyarılara oldukça farklı yanıt verdiği gösterilmiştir (4). Dahası, hpaA geninin silinmesi, bakterilerin daha önce tanımlanmış H. pylori bağlayıcı glikosfingolipidlere ince tabakalı kromatogramlar üzerinde bağlanmasıyla değerlendirildiği üzere, bakterilerin glikosfingolipid tanıma modelini etkilememiştir (1). Bu nedenle, hem ana SS1 suşu hem de HpaA nakavt mutantı, laktosilseramid, gangliotetraosilseramid, laktotetraosilseramid ve Leb-sonlu glikosifingolipidlere bağlanmıştır (S. Teneberg ve diğerleri, yayınlanmamış veriler). Bu nedenle, HpaA'nın bizzat kendisinin reseptör bağlanmasına doğrudan aracılık edip etmediği veya adhezin taşınmasını ve katlanmasını kolaylaştırmada yer alıp almadığı veya düzenleyici işlevler uygulayıp uygulamadığı tahmin edilebilir. HpaA'nın rolü ilerideki araştırmalarda açıklanmalıdır.
Sonuç olarak, HpaA şifreleyen genin bozulmasının, yabani tip suş ile karşılaştırıldığında mutantta protein ekspresyon modelinde herhangi bir büyük farklılığa neden olmadığını gösterdik. Ayrıca, HpaA'nın in vivo HpaA'nın fizyolojik bir rolünü ilk kez oluşturarak, farelerin mide mukozasında bakteriyel kolonizasyon için gerekli olduğunu da gösterdik.
Öz
İnsan mide patojeni Helicobacter pylori ile enfeksiyon kronik gastrit, peptik ülser ve mide kanserine yol açabilir. Tüm H. pylori suşları, H. pylori enfeksiyonuna karşı bir aşı için umut verici bir aday olan yüzeyde lokalize protein HpaA'yı ifade eder. İncelemek içinHpaA'nın fizyolojik önemi, hpaA geninin bir mutasyonu, fareye uyarlanmış bir H. pylori suşuna dahil edildi. HpaA geninin kesintiye uğramasının aşağı akış genlerinde herhangi bir polar etkiye neden olmadığını veya ikinci bir bölge mutasyonu ile ilişkili olduğunu doğrulamak için, mutant ve vahşi tip suşların protein ekspresyon modelleri iki farklı proteomik yaklaşımla karakterize edildi. Dış zar protein profili için nano-sıvı kromatografi-Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans kütle spektrometresi ile birleştirilmiş tam hücre özütlerinin ve alt hücresel fraksiyonlamanın iki boyutlu diferansiyel jel içi elektroforez analizi, mutant ve vahşi arasındaki protein profilinde sadece küçük farklılıklar ortaya çıkardı -tip suşlar. Bu nedenle, mutant suş, iyi kurulmuş bir fare modelinde kolonileşme yeteneği açısından test edildi. Yabani tip suş ile aşılama, ağır şekilde H. pylori ile enfekte olmuş farelere yol açarken, HpaA mutant suşu kolonizasyon oluşturamadı. Bu nedenle, proteomik analizi ve in vivo çalışmaları birleştirerek, HpaA'nın H. kolonizasyonu için gerekli olduğu sonucuna vardık.
ÖZ
İnsan mide patojeni Helicobacter pylori ile enfeksiyon kronik gastrit, peptik ülser ve mide kanserine yol açabilir. Tüm H. pylori suşları, H. pylori enfeksiyonuna karşı bir aşı için umut verici bir aday olan yüzeyde lokalize protein HpaA'yı ifade eder. HpaA'nın fizyolojik önemini incelemek için, hpaA geninin bir mutasyonu, fareye uyarlanmış bir H. pylori suşuna dahil edildi. HpaA geninin kesintiye uğramasının aşağı akış genlerinde herhangi bir polar etkiye neden olmadığını veya ikinci bir bölge mutasyonu ile ilişkili olduğunu doğrulamak için, mutant ve vahşi tip suşların protein ekspresyon modelleri iki farklı proteomik yaklaşımla karakterize edildi. Dış zar protein profili için nano-sıvı kromatografi-Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans kütle spektrometresi ile birleştirilmiş tam hücre özütlerinin ve alt hücresel fraksiyonlamanın iki boyutlu diferansiyel jel içi elektroforez analizi, mutant ve vahşi arasındaki protein profilinde sadece küçük farklılıklar ortaya çıkardı -tip suşlar. Bu nedenle, mutant suş, iyi kurulmuş bir fare modelinde kolonileşme yeteneği açısından test edildi. Yabani tip suş ile aşılama, ağır şekilde H. pylori ile enfekte olmuş farelere yol açarken, HpaA mutant suşu kolonizasyon oluşturamadı. Bu nedenle, proteomik analizi ve in vivo çalışmaları birleştirerek, HpaA'nın farelerde H. pylori kolonizasyonu için gerekli olduğu sonucuna vardık.
H. pylori adhesin A (HpaA), başlangıçta sialik asit bağlayıcı adhezin olarak tanımlanan, yüzeyde bulunan (7, 14, 20) bir lipoproteindir (25), ancak destekleyici kanıtlar hala eksiktir. H. pylori ile enfekte bireylerden elde edilen antikorlar tarafından tanınır (23, 39) ve HpaA proteininin ekspresyonunun daha önce H. pylori izolatları arasında yüksek oranda korunduğu bulunmuştur (9, 39). Dahası, genomik çalışmalar (2, 32) HpaA'nın diğer bilinen proteinlerle önemli bir dizi homolojisi göstermez. Birlikte ele alındığında bu, HpaA'yı H. pylori enfeksiyonuna karşı bir aşı antijeni olarak varsayılan bir aday yapar.
Bu çalışmada, kolonizasyonda HpaA'nın rolünü incelemek için fareye uyarlanmış H. pylori Sydney suşu 1'de (SS1) bir HpaA mutantı oluşturduk. Birlikte transkripsiyon nedeniyle, yapılandırılmış gen mutasyonları, polar etkilere, yani bir operonda aşağı akım genlerin ekspresyonunu inhibe etme potansiyeline sahiptir. Ek olarak, bir genin devreden çıkarılmasının diğer genleri önceden tahmin edilemeyen bir şekilde etkileyebileceği gösterilmiştir (30). Bu nedenle, bir mutantı incelerken, proteomik analiz, bu değişikliklerin ne olabileceğine dair önceden bilgi sahibi olmadan protein ekspresyonundaki değişiklikleri izlemek için uygun bir yöntem sunar.
Bu çalışmanın ilk amacı, fareye uyarlanmış SS1 suşu ve onun izojenik HpaA mutantının hpaA'nın aşağı akışında bulunan genlerin protein ekspresyonu dahil olmak üzere genel protein profilini incelemekti. Bu, bakterilerin tam hücre özütlerinin DIGE analizi ile karşılaştırıldığı proteomik bir yaklaşımla başarıldı. Ayrıca hücre altı fraksiyonlama ve tek boyutlu sodyum dodesil sülfat (SDS) -poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) analizini nano-LC Fourier dönüşümü (FT) iyon siklotron rezonansı (ICR) (FT-ICR) MS ve tandem MS (MS / MS) SS1 vahşi tip ve mutant suşların OMP profillerini karşılaştırmak için analiz eder. HpaA'nın konakçıda hayatta kalmak için gerekli olup olmadığını belirlemek için, farelere H. pylori SS1 veya HpaA mutant suşu ile enfekte edildi ve kolonizasyon seviyeleri
MALZEMELER VE YÖNTEMLER
SS1 hpaA-negatif / eksik mutant SS1'in (ΔhpaA) yapımı.
HpaA mutantı, ilk olarak H. pylori suşu CCUG 17874'te, hpaA geninin 450 bp'lik bir delesyonu ile sonuçlanan iki aşamalı bir amplifikasyonla oluşturuldu (nazikçe P.Doig ve arkadaşları, Astrazeneca Research Center, Boston, MA) 1.4 kb'lik bir kanamisin kasetinin (25) yerleştirilmesi. Mutasyon, H. pylori CCUG 17874'ten doğal dönüşüm ile fareye uyarlanmış SS1 suşuna aktarıldı. Beş kanamisine dirençli transformant, kanamisin kasetinin yerleştirildiğini doğrulamak için iki HpaA'ya özgü primer (ileri primer, 5′-GGCGTAGAAATGGAAGCG-3 ′; ters primer, 5′-CCCAAGCTTCATCAGCCCTTAAATACACG-3 ′) (21) ile PCR ile analiz edildi. hpaA geni, vahşi tip SS1 suşununkinden daha büyük bir PCR ürünü ile sonuçlanır. Doğru yerleştirmeye sahip transformantlardan biri ayrıca SDS-PAGE ve HpaA'ya özgü monoklonal antikor HP30-1: 1: 6 ile immünoblotlama ile karakterize edildi (9). Bu suş, SS1 (ΔhpaA), immünoblotta negatifti.
Suşlar ve kültür koşulları.
Fareye uyarlanmış H. pylori suşları SS1 (CagA + VacA + Ley) (19) ve SS1 (ΔhpaA) tüm deneylerde kullanılmış ve stok kültürler olarak -70 ° C'de saklanmıştır. SS1 ve SS1'den (ΔhpaA) antijenlerin hazırlanması için bakteriler, mikroaerofilik koşullar altında (% 10 CO2,% 6 O2 ve% 84 N2) Kolombiya-Iso agar plakalarında 3 gün boyunca birleşmek üzere büyütüldü. SS1 (ΔhpaA), 25 μg / ml kan ile desteklenen kültürler haricinde, deney boyunca SS1 ile aynı şekilde kültürlendi.amisin.
Büyüme eğrileri.
SS1 ve SS1 (ΔhpaA) önce Kolombiya-Iso plakalarında 2 ila 3 gün boyunca birleşecek şekilde büyütüldü ve ardından 2 ml Brucella broth (Difco Laboratories) içinde 600 nm'de (OD600) 0.3 (1.5 × 109 bakteri) optik yoğunluğa yeniden süspanse edildi / ml). On altı dişi C57BL / 6 faresi, daha önce tarif edildiği gibi anestezi altında (Isoflurane; Abbott Scandinavia Ab, Solna, İsveç) Brucella besiyerinde yaklaşık 109 CFU H. pylori SS1 veya SS1 (ΔhpaA) ile oral yoldan enfekte edildi (27).
Enfekte farelerde H. pylori SS1 (vahşi tip) ve SS1 (ΔhpaA) tespiti. (i) Kantitatif kültür.
Farelerin kolonizasyonundaki SS1'in kinetiği, 2 ila 8 haftalık enfeksiyon arasında stabil kolonizasyon gösteren iyi karakterize edilmiştir (27). Farelerde SS1 (ΔhpaA) ile kolonizasyon kinetiğini belirlemek için, hayvanlar enfeksiyondan sonra çeşitli zaman noktalarında (3 gün, 3 hafta ve 8 hafta) öldürüldü. Mideler çıkarıldı ve gıda kalıntılarını çıkarmak için fosfat tamponlu salin ile yıkandı. Midenin bir yarısı daha önce tarif edildiği gibi kantitatif kültür için kullanıldı (27) ve diğer yarısı, PCR ile H. pylori'ye özgü genlerin saptanması için kullanıldı. SS1 (ΔhpaA) ile enfekte edilmiş farelerden alınan mide homojenatları, mide enfeksiyonu sırasında antibiyotik direncini kaybedip kaybetmediklerini incelemek için kan Skirrow plakalarında hem kanamisin içeren hem de içermeyen kültürlendi.
SONUÇLAR
H. pylori suşları SS1 ve SS1'deki (ΔhpaA) başlıca proteom bileşenlerinin karşılaştırılması.
HpaA mutantının yapısını takip eden hiçbir spesifik protein ekspresyon değişikliğinin olmadığını belirlemek için, H. pylori suşu SS1'in proteomunu ve izojenik mutantını 2-DE bazlı DIGE sistemi ile analiz ettik. DIGE teknolojisi ile uyumlu hücre liziz tamponunun kullanılması ve 3 ila 10 pH aralığında izoelektrik odaklanma ile, dört kopyadaki her bir numuneden 800'den fazla farklı protein noktası, DeCyder yazılımı ve ardından manuel düzeltme ile tespit edildi. SS1 suşu ve SS1 (ΔhpaA) mutantındaki ekspresyon profillerinin analizi, önemli ölçüde değişen bir seviyeye (P <0.05) sahip az sayıda noktanın (13) tanımlanmasıyla sonuçlandı. Bu noktalardan sekizinin aşağı regüle edildiği ve beş noktasının SS1 (ΔhpaA) mutantında yukarı regüle edildiği bulundu (Şekil 1) .1). Proteinlerin tanımlanması için, bir preparatif jel Sypro ruby ile boyandı ve noktalar jelde sindirildi ve nano-LC FT-ICR MS ve MS / MS ile analiz edildi. Tablo1.1'de gösterilen proteinleri başarıyla belirledik. Özellikle, hpaA'nın aşağı akışında yer alan tig geninin kodladığı tetikleme faktörü, her iki suşta da benzer seviyelerde ekspresyon gösterdi (Şekil 11 ve 2) .2). Bununla birlikte, Omp18 (HP0796) ne vahşi tip suşta ne de mutantta saptanmıştır. Bu nedenle, hpaA geninin bozulmasının, aşağı akış geni omp18'in transkripsiyonunu etkilemediğinden emin olmak için, SS1 ve SS1 (ΔhpaA) mutant suşu üzerinde omp18'e özgü bir RT-PCR gerçekleştirildi ve bu, Omp18'in her iki suş (veriler gösterilmemiştir).
Enfekte farelerde bakteri tespiti.
H. pylori kolonizasyonu hem kantitatif kültür hem de H. pylori'ye özgü PCR ile tespit edildi. SS1 (ΔhpaA) için kolonizasyon modelini değerlendirmek için, fareler referans olarak SS1 (ΔhpaA) veya SS1 ile enfekte edildi ve ardından 3 gün ila 2 ay arasında değişen çeşitli zaman noktalarında öldürüldü. SS1 ile enfekte olan fareler, incelenen tüm zaman noktalarında büyük bir kolonizasyon gösterdi, ancak kültür yoluyla (Şekil (Şekil 5) 5) veya H. pylori ile SS1 (ΔhpaA) ile enfekte olmuş farelerin midelerinde bakteri tespit edilemedi. - herhangi bir zaman noktasında belirli PCR (veriler gösterilmemiştir). SS1'in (ΔhpaA) midede kolonizasyon sırasında kanamisin direncini kaybetmediğini doğrulamak için bakteriler kanamisin içeren ve içermeyen plakalar üzerinde büyütüldü. Bununla birlikte, kanamisin içermeyen plakalarda kültürden sonra da hiçbir bakteri tespit edilememiştir (veriler gösterilmemiştir).
TARTIŞMA
Hayvan modellerinde yapılan bağışıklama çalışmalarında birçok kolonizasyon ve virülans faktörü koruyucu antijenler olarak değerlendirilmiştir (17, 22). Bir bakteri proteininin bir aday aşı antijeni olarak kabul edilmesi için, tercihen korunması (yani, tüm suşlarda mevcut olması), salgılanması veya yüzeyde lokalize olması ve immünojenik (yani, bağışıklık sistemini uyarabilen) olması gerekir. HpaA tüm bu kriterleri karşılar; HpaA'yı kodlayan gen, tüm H. pylori izolatlarında bulunur ve bunlar tarafından eksprese edilir (9, 39), bu da bakteri için değerli olduğunu gösterir. Dahası, H. pylori ile enfekte denekler, bakterinin yok edilmesinden sonra düşen HpaA'ya karşı serum antikor yanıtları oluşturur (23, 37) ve HpaA, immünojenisitesini göstererek dendritik hücrelerin olgunlaşmasını ve antijen sunumunu indükler (36). Ek olarak, HpaA'nın hem hücre içinde hem de bakteri yüzeyinde ifade edildiği gösterilmiştir (20, 25).
H. pylori enfeksiyonunda HpaA'nın önemini araştırmak için, daha önce açıklanan bir HpaA (25) mutasyonu, fareye uyarlanmış SS1 suşuna dahil edildi ve mutant suş, kolonizasyon kabiliyeti açısından test edildi veiyi kurulmuş bir hayvan modelinde immünojenite.
Mutasyonun aşağı akış genlerinde veya ikinci bölge mutasyonlarında herhangi bir hasara neden olmadığını doğrulamak için, H. pylori suşu SS1'in genel protein ekspresyon modelini incelemek için 2-D DIGE analizi gerçekleştirdik. HpaA haricinde yabani tip suşta saptanan tüm protein noktaları, mutant suşta bulundu. Bununla birlikte, 11 benzersiz proteine karşılık gelen 13 nokta, yabani tip suş ile karşılaştırıldığında mutantta ekspresyon seviyelerinde küçük değişiklikler gösterdi; bunlardan yedi proteinin aşağı regüle olduğu ve dört proteinin yukarı regüle edildiği bulundu. Tanımlanan bu proteinler, genetik veya fonksiyonel düzeyde ilişkili görünmemektedir. Ek olarak, protein ekspresyon seviyesindeki küçük değişikliklerin normalde bir bakteri suşu (35) içinde meydana geldiği gösterilmiştir (E. Carlsohn ve diğerleri, yayınlanmamış veriler). Yabani tipin ve izojenik mutantının DIGE analizindeki en önemli bulgu, hpaA'nın aşağı akışında yer alan tig geninin kodladığı tetikleme faktörünün her iki suşta da benzer ekspresyon seviyeleri göstermesiydi.
OMP'lerin toplam hücre ekstraktı gösteren standart 2-DE'de ayırt edilme eğiliminde oldukları iyi bilinmektedir. Bu, ilgilenilen proteinlerin hem zayıf çözünürlük hem de düşük ekspresyon seviyelerinden kaynaklanmaktadır ve bu nedenle, bu protein türleri için uygun bir izolasyon prosedürünün tasarlanması önemlidir. Tek boyutlu PAGE analizi ve triptik peptitlerin nano-LC FT-ICR MS ve MS / MS analizleri ile kombinasyon halinde OMP'lerin hücre altı fraksiyonasyonunu gerçekleştirdik. Bu yeni yaklaşımı kullanarak, araştırılan her iki suşta 20'den fazla dış zar proteini ve 8 flagella ile ilişkili protein belirledik. HpaA haricinde vahşi tip suşta bulunan tüm OMP'ler ayrıca mutant suşta ifade edildi. HpaA ve aşağı yönde gen omp18'in birlikte transkripsiyonu daha önce tarif edilmiştir (20). Bu nedenle, mutantta çevreleyen genler üzerindeki olası polar etkileri araştırmak için yapılandırılmış HpaA mutantında omp18 gen ürününün ekspresyonunu incelemek ilgi çekiciydi. Ne yazık ki, Omp18 proteini suşların hiçbirinde tespit edilmedi. Bununla birlikte, yabani tip ve mutant suşlardan omp18 mRNA'nın RT-PCR analizi, omp18'in her iki suşta da transkribe edildiğini açıkça gösterdi; bu, hpaA'nın bozulmasının, aşağı akım genleri üzerinde herhangi bir polar etkiye sahip olmadığını gösterdi (veriler gösterilmemiştir). Ek olarak, bildiğimiz kadarıyla, Omp18 proteini hiçbir zaman tespit edilmedi, bu da bunun çevrilmeyebileceğini, ancak sadece mRNA seviyesinde mevcut olabileceğini düşündürdü. İki suş arasında büyük bir fark tespit edilemediğinden, HpaA'nın fizyolojik öneminin değerlendirilmesi için bir hayvan modeline geçtik.
In vivo çalışmalar, vahşi tip SS1 suşu ile enfekte olan farelerin yoğun şekilde kolonize edildiğini, izojenik mutantının incelenen tüm zaman noktalarında fareleri kolonize edemediğini gösterdi. Bu nedenle, mutantın laboratuvar koşullarında büyümede önemli farklılıklar göstermemesi gerçeği, gözlemlenen fenotipin kesinlikle in vivo bağımlı olduğunu gösterir.
HpaA başlangıçta varsayılan bir N-asetilneuraminyllactose-bağlayıcı hemaglutinin olarak işaret edildi ve birkaç çalışma, in vitro yapışma çalışmalarında HpaA'nın işlevini aydınlatmaya çalıştı, ancak sonuçlar kesin değil. Örneğin, in vitro olarak mide hücre dizilerine bakteriyel bağlanma, inaktive edilmiş bir hpaA geninden etkilenmemiştir (25). Bununla birlikte, epitel hücre hatlarının, yeni izole edilmiş epitel hücrelerine kıyasla bakteriyel uyarılara oldukça farklı yanıt verdiği gösterilmiştir (4). Dahası, hpaA geninin silinmesi, bakterilerin daha önce tanımlanmış H. pylori bağlayıcı glikosfingolipidlere ince tabakalı kromatogramlar üzerinde bağlanmasıyla değerlendirildiği üzere, bakterilerin glikosfingolipid tanıma modelini etkilememiştir (1). Bu nedenle, hem ana SS1 suşu hem de HpaA nakavt mutantı, laktosilseramid, gangliotetraosilseramid, laktotetraosilseramid ve Leb-sonlu glikosifingolipidlere bağlanmıştır (S. Teneberg ve diğerleri, yayınlanmamış veriler). Bu nedenle, HpaA'nın bizzat kendisinin reseptör bağlanmasına doğrudan aracılık edip etmediği veya adhezin taşınmasını ve katlanmasını kolaylaştırmada yer alıp almadığı veya düzenleyici işlevler uygulayıp uygulamadığı tahmin edilebilir. HpaA'nın rolü ilerideki araştırmalarda açıklanmalıdır.
Sonuç olarak, HpaA şifreleyen genin bozulmasının, yabani tip suş ile karşılaştırıldığında mutantta protein ekspresyon modelinde herhangi bir büyük farklılığa neden olmadığını gösterdik. Ayrıca, HpaA'nın in vivo HpaA'nın fizyolojik bir rolünü ilk kez oluşturarak, farelerin mide mukozasında bakteriyel kolonizasyon için gerekli olduğunu da gösterdik.
Öz
İnsan mide patojeni Helicobacter pylori ile enfeksiyon kronik gastrit, peptik ülser ve mide kanserine yol açabilir. Tüm H. pylori suşları, H. pylori enfeksiyonuna karşı bir aşı için umut verici bir aday olan yüzeyde lokalize protein HpaA'yı ifade eder. İncelemek içinHpaA'nın fizyolojik önemi, hpaA geninin bir mutasyonu, fareye uyarlanmış bir H. pylori suşuna dahil edildi. HpaA geninin kesintiye uğramasının aşağı akış genlerinde herhangi bir polar etkiye neden olmadığını veya ikinci bir bölge mutasyonu ile ilişkili olduğunu doğrulamak için, mutant ve vahşi tip suşların protein ekspresyon modelleri iki farklı proteomik yaklaşımla karakterize edildi. Dış zar protein profili için nano-sıvı kromatografi-Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans kütle spektrometresi ile birleştirilmiş tam hücre özütlerinin ve alt hücresel fraksiyonlamanın iki boyutlu diferansiyel jel içi elektroforez analizi, mutant ve vahşi arasındaki protein profilinde sadece küçük farklılıklar ortaya çıkardı -tip suşlar. Bu nedenle, mutant suş, iyi kurulmuş bir fare modelinde kolonileşme yeteneği açısından test edildi. Yabani tip suş ile aşılama, ağır şekilde H. pylori ile enfekte olmuş farelere yol açarken, HpaA mutant suşu kolonizasyon oluşturamadı. Bu nedenle, proteomik analizi ve in vivo çalışmaları birleştirerek, HpaA'nın H. kolonizasyonu için gerekli olduğu sonucuna vardık.
